CRISPR-Cas9 : une révolution dans l’édition génétique

Raphael Chevrier & Eliott Teston
Raphael Chevrier & Eliott Teston

Transgénèse vs mutagénèse.

Les premières techniques d’édition génétique ont été utilisées afin de donner un caractère d’intérêt supplémentaire à une espèce ciblée, végétale ou animale, telle qu’une résistance à un parasite (un exemple connu concerne le gène Bt, ajouté au maïs pour le rendre résistant au parasite pyrale). Cette technique permettant d’ajouter un gène dans le patrimoine génétique d’une espèce s’appelle la transgenèse, et la nouvelle espèce produite est qualifiée d’organisme génétiquement modifié (OGM). Cette technique a permis à l’industrie agro-alimentaire de développer des variétés résistantes à différentes formes de stress dues à des parasites ou à des conditions environnementales difficiles, telle que la sécheresse.Moins invasive, la mutagénèse correspond à l’introduction de modifications aléatoires dans le génome d’une espèce, lesquelles peuvent entraîner l’apparition de nouveaux caractères. De telles modifications dans la séquence d’ADN sont généralement obtenues par l’effet de certains agents chimiques, à mêmes de remplacer une base A, T, G, ou C par une autre. A la différence de la transgénèse, qui correspond à l’insertion d’une séquence nouvelle d’ADN, la mutagénèse se limite à la modification de l’information au niveau d’un gène. Cette technique est très utilisée dans l’amélioration d’espèces, par exemple chez des tournesols devenus spontanément tolérants à certains herbicides.

Les gènes, une espèce mobile.

Pour développer les techniques d’édition génétique, les scientifiques se sont reposés sur un phénomène étonnant, découvert indirectement dès 1900 lorsque trois biologistes britanniques, Bateson, Saunders et Punnett, remarquent des ‘anomalies’ statistiques dans la transmission de caractères héréditaires. En travaillant sur deux caractères bien particuliers d’une espèce de fleur, à savoir la couleur (rouge ou violette) et la forme des grains de pollen (longs ou ronds), les chercheurs remarquent que la génération obtenue par le croisement de deux lignées pures ne correspond pas tout à fait aux prévisions. Certaines combinaisons héritées (couleur violette et grains longs, couleur rouge et grains ronds) sont surreprésentées par rapport à l’attendu.

Il faut attendre onze ans pour que Thomas Morgan, un biologiste américain, suggère qu’il doit se produire un phénomène d’enjambement (crossing over en anglais) entre différents chromosomes : un ou plusieurs gènes pourraient passer naturellement d’un chromosome à un autre, expliquant ces anomalies statistiques dans la transmission des gènes. Vingt ans plus tard, au début des années 30, deux botanistes et généticiennes américaines mettent en lumière ce phénomène d’échange d’information génétique entre deux chromosomes chez le maïs. Harriet Creighton prépare alors une thèse de doctorat sous la direction de Barbara McClintock, laquelle s’est vue décerner le prix Nobel de médecine en 1983 pour « sa découverte d’éléments génétiques mobiles ». Il devient évident que l’ADN est une molécule flexible, qui évolue avec le temps et les générations, et potentiellement manipulable et modifiable.

La saga des Nobels ne s’arrête pas là. En 1947, Joshua Lederberg, un autre biologiste américain, démontre à seulement 22 ans que certaines bactéries d’une même espèce peuvent s’échanger des gènes sans avoir recourt à la reproduction. Lederberg recevra lui aussi le plus prestigieux des prix scientifiques pour ses travaux, en 1958. Dans les années 80, le biologiste canadien-américain Jack Szostak, également nobélisé, identifie les mécanismes moléculaires à l’origine de ces ‘enjambements’, qui seront rebaptisés ‘recombinaisons’. La compréhension de ces mécanismes de rupture du double brin d’ADN ouvre la voie aux premières applications de modifications du génome, notamment l’insertion de nouveaux gènes.

Des protéines coupeuses d’ADN.

Pour réaliser de telles modifications du génome, les scientifiques ont donc besoin de comprendre et maîtriser ces mécanismes moléculaires à l’origine de ces mouvements de gènes. Ils doivent également disposer d’instruments pour mener à bien leur acte chirurgical. De tels outils existent en laboratoire depuis les années 60, et n’ont cessé d’évoluer, de se perfectionner avec le temps. En effet, certaines protéines – les endonucléases – sont spécialement conçues pour reconnaître une courte séquence de l’ADN et la couper en son milieu. En revanche, les morceaux d’ADN visés sont peu spécifiques : la première endonucléase est capable d’identifier des séquences de 6 paires de bases. Or, statistiquement, une telle séquence apparaîtra aléatoirement toutes les 4096 bases, soit… plus de 830 000 fois dans notre génome ! Résultat : les protéines iront couper un peu partout dans l’ADN.

L’identification précise d’un gène repose, pour une protéine, sur sa capacité à reconnaître des séquences de paires de bases les plus longues possible. Par analogie humaine, le cliché d’une main ne nous permettrait pas de remonter à l’identité d’un individu, pour la simple et bonne raison que des milliers de personnes partageront cette caractéristique. La photographie d’un bras permettra en revanche de resserrer la liste à des centaines d’individus. Seul le cliché du corps tout entier permettra d’identifier une personne sans risque de se tromper.

C’est le cas pour les méganucléases, des endonucléases dont la séquence de reconnaissance peut aller de 12 à 40 paires de bases. La probabilité d’apparition d’une séquence de 12 nucléotides retombe à une tous les 17 millions de bases. Autrement dit, une la séquence n’apparaîtra qu’environ 200 fois sur l’ensemble de l’ADN. Mécaniquement, plus la séquence reconnue est longue, moins elle aura de chance d’apparaître de façon aléatoire à un autre endroit du génome. De sorte que chaque ajout de base (de 12 à 13, de 13 à 14, etc) diminuera d’un facteur 4 la probabilité d’apparition de la séquence cherchée. En poussant le calcul un peu plus loin, on peut montrer qu’à partir de 16 bases, la séquence n’est probablement présente qu’une seule fois dans le génome, permettant ainsi de cibler une zone très précise de l’ADN. La tâche n’en reste pas moins ardue, car chaque méganucléase, sorte de tête chercheuse, doit être créée en laboratoire afin de reconnaître une zone spécifique de l’ADN à couper. Généralement chronophage, la mise au point de ces techniques est également très coûteuse.

Les premiers OGM

La première souris transgénique voit le jour en 1974. Elle est le résultat de travaux entamés dans les années 1960 afin de remplacer une séquence d’ADN ciblée dans le génome. Ici, la particularité repose sur le la manipulation in vitro d’un gène dans des embryons de souris, avant de les réimplanter chez l’animal. De sorte que, non seulement la souris porte un gène introduit artificiellement, mais cette modification sera transmise de générations en générations. Preuve de l’impact sociétal de ce domaine de recherche, trois généticiens reçoivent à leur tour, en 2007, le plus prestigieux des prix scientifiques pour cette « découverte de principes pour introduire des modifications génétiques spécifiques chez la souris en utilisant des cellules souches embryonnaires ».

L’ennui, c’est que la technique de transgénèse ne permet pas de contrôler précisément l’endroit où le gène étranger s’insère dans le génome, ni combien de fois il le fait. En effet, cette méthode de modification génétique reste dictée par des insertions ‘opportunistes’ des séquences d’ADN, profitant du phénomène de recombinaison qui s’avère relativement aléatoire, donc incontrôlable. Ce manque de précision et ces « greffes » imprévisibles peuvent à la fois limiter l’efficacité du procédé, et engendrer des effets secondaires indésirables au sein de l’organisme. Une transgénèse ratée peut ainsi perturber l’expression d’autres gènes essentiels au bon fonctionnement cellulaire. Pour rendre cette technique facile d’utilisation et polyvalente, l’enjeu consiste à développer des ‘outils’ d’édition génétique permettant de mieux cibler l’endroit de l’ADN à sectionner, afin de provoquer des recombinaisons à volonté et en augmenter ainsi l’efficacité. Développées au début des années 2000, les nucléases à doigts de zinc, ou les TALENs (pour ‘‘transcription activator-like effector nucleases’’), sont d’autres types de protéines plus simples d’utilisation. Cependant, elles nécessitent toujours de synthétiser une nouvelle protéine pour chaque morceau d’ADN que l’on souhaite modifier, rendant impossible l’utilisation à grande échelle de ces techniques.

C’est dans ce contexte que la révolution CRISPR-Cas9 aura lieu.

CRISPR-Cas9, l’outil ctrl_c/ctrl_v de l’ADN

En 2012, les biochimistes française Emmanuelle Charpentier et américaine Jennifer Doudna publient dans la revue Science une étude expliquant le fonctionnement d’un système appelé CRISPR/Cas9, pour ‘‘clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated system’’. Cette appellation quelque peu barbare fait référence à un système d’auto-défense observé chez certaines bactéries. Quelques années plus tôt, des chercheurs étudiant les mécanismes de résistance chez la bactérie E. coli. débusquent dans leur génome des séquences bien particulières : ce sont de courtes répétitions palindromiques groupées (elles peuvent se lire dans les deux sens, comme les mots “radar” ou “kayak”) et sont régulièrement espacées. Plus surprenant encore : intercalés entre ces séquences, les chercheurs identifient des morceaux d’ADN ressemblant… à ceux de certains virus ! Mieux : les bactéries portant ces fragments d’ADN de virus résistent mieux aux infections virales que les autres. En réalité, en intégrant directement dans leur génome des fragments d’ADN de virus ennemis, les bactéries peuvent procéder à des ripostes rapides en cas d’attaque. CRISPR leur permet d’identifier facilement ces virus, de s’en approcher et de sectionner littéralement leur ADN au moyen de la protéine Cas9 ! CRISPR la tête chercheuse et Cas9 la paire de ciseaux moléculaires sont plus forts qu’un vaccin : en intégrant directement ce système d’auto-défense dans leur ADN, les bactéries sont capables de le transmettre de génération en génération.

Par sa capacité à reconnaitre puis à sectionner un double brin d’ADN, CRISPR/Cas9 est assez similaire aux endonucléases citées précédemment. A la différence de ses prédécesseurs, cependant, ce n’est pas une protéine, mais deux brins d’ARN – transcrits directement à partir de la séquence CRISPR – qui permettent au système de reconnaître l’endroit de l’ADN à couper. Ainsi, il suffit aux biochimistes de remplacer la séquence virale CRISPR par n’importe quelle autre fraction d’ARN afin de cibler un gène souhaité. Or, s’il est relativement compliqué de concevoir une protéine et de la synthétiser en laboratoire, il est facile et tout à fait courant de synthétiser un ARN, ou plus simplement de l’acheter à un fabricant spécialisé. De plus, dans cette publication, les auteures montrent que ces deux brins peuvent être fusionnés en un seul, permettant de simplifier encore davantage l’utilisation de l’outil.

Ensemble, l’ARN et la protéine Cas forment un système de « ciseaux moléculaires » à ADN ultra précis, beaucoup plus facile à utiliser et beaucoup moins coûteux que toutes les méthodes d’édition génétique envisagées jusque-là.

Des applications illimitées

Dans les laboratoires comme en médecine, CRISPR/Cas9 est une vraie révolution : cette technique permet aux chercheurs comme aux industriels de modifier facilement et précisément le génome afin d’étudier des pathologies, des mécanismes biologiques ou de créer de nouvelles espèces. Le nombre de publications scientifiques citant CRISPR est passé de moins de 50 en 2010 à plus de 3000 en 2018. En octobre 2020, Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna se voient décerner le prix Nobel de Chimie pour leurs travaux, prouvant l’impact de cette découverte sur la communauté scientifique et le grand public.

Si des applications de plus en plus élaborées et prometteuses en thérapie génique ont vu le jour ces dernières années, quelques expériences ou nouvelles perspectives ont parfois alarmé la communauté scientifique et le public concernant de potentielles dérives eugénistes. Deux collectifs de scientifiques ont d’ailleurs rapidement publié des tribunes dans les journaux Science et Nature pour militer contre l’utilisation de CRISPR/Cas9 dans les gamètes humains. D’autant que n’importe quel chercheur ayant une formation de base en biologie moléculaire est désormais capable d’utiliser cette technique. Les enjeux et questionnements éthiques ont fleuri aussi vite que les travaux de recherches, et les débats restent d’actualité, récemment alimentés par une expérience chinoise ayant mené aux premières naissances de bébés génétiquement modifiés.

Eliott Teston

Chimiste de formation, Eliott fait aujourd'hui de la recherche en biologie vasculaire à l'hôpital universitaire de Leiden aux Pays Bas

Raphaël ChevrierDocteur en physique, chroniqueur scientifique, auteur de "Ça alors! Histoire de ces découvertes que l'on n'attendait pas" (La librairie Vuibert, 2018) et de "Comment avoir un avis sans raconter n'importe quoi. La science et les grandes questions d'aujourd'hui" (à paraître aux éditions Buchet-Chastel en mars 2021).


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